Лекція 5. Транспорт електронів. Протонний градієнт. Окисне фосфорилування.

Ключові питання:

Редокс-потенціал – сила, що визначає напрям потоку електронів на кисень у дихальному ланцюгу.

Багатоланковий дихальний ланцюг – умова поступового звільнення енергії електронів. Вільна енергія електронів забезпечує трансмембранний перенос протонів, трансмембранний елктрохімічний потенціал.

Зворотня дифузія протонів  з трансмембранного простіру через білки АТФ синтази  призводить синтез АТФ!

Завдання лекції – уяснити механізм переміщення протонів і електронів з відновлених у реакціях ЦТК коферментів у дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій.

 Мітохондрион  — сукупність мітохондрий в клітині.

Велика частина аеробного окислення біомолекул у еукаріот відбувається в мітохондрії. Ця органела є місцем циклу лимонної кислоти і окислення жирних кислот, обидва з яких генерують відновні

Рис.1 — Мітохондрион

коферменти. Коферменти окислюються у транспортних комплексах електронів, структурах, що вбудовані в мітохондріальні мембрани.

Вміст мітохондрий в клітинах різко змінюється. Деякі одноклітинні водорості містити тільки одну мітохондрію в той час як клітина найпростіших Chaoschaos містить півмільйона мітохондрій. Клітина печінки ссавців містить до 5000 мітохондрій. Кількість мітохондрій пов’язана із загальною енергетичною потребою клітини.

Білі м’язові тканини, наприклад, для своїх потреб в енергії покладається на анаеробний гліколіз, тому віни містить відносно мало мітохондрій. Мітохондрії сильно розрізняються за розміром і формою у різних видів, у різних тканин і навіть в клітинці. Мітохондрії відокремлені від цитоплазми подвійною мембраною. Дві мембрани мають помітно різні властивості. Зовнішня мітохондріальна мембрана має кілька білків. Одним з таких білків є трансмембранний білок порин, який формує канали, що дозволяють вільну

дифузію іонів і водорозчинних метаболітів з молекулярними масами менше 10000. На противагу цьому, внутрішня мітохондріальна мембрана дуже багата білком із співвідношенням білок/ліпід близько 4:1 за масою. Ця мембрана є проникною для незаряджених молекул, таких як вода, O2, CO2, але є перешкодою для протонів і великих полярних та іонних речовин. Ці полярні необхідні речовини активно транспортується через внутрішню мембрану з використанням специфічних транспортних білків, таких як піруват транслоказа. Вступ аніонних метаболітів у негативно заряджений інтер’єр мітохондрії енергетично невигідно. Такі метаболіти, як правило, обмінюються на інші внутрішні аніони.

Внутрішня мембрана часто вельми складена в результаті чого значно збільшюється площа поверхні. Складки називаються кристи. Розширення і складання внутрішньої мембрани також створює значно розширений міжмембранний простір. Зовнішня мембрана вільно проникна для малих молекул, міжмембранний простор має приблизно такий же склад іонів і метаболітів, як цитозоль, який оточує митохондрию.

Вміст матриксу включають дегідрогенази комплексу пірувату, ферменти циклу лимонної кислоти (для сукцинатдегідрогенази комплексу, який крім того вбудований у внутрішню мембрану), і більшість ферментів, які каталізують окислення жирних кислот.

Концентрація білка в матриксі дуже висока (наближається до 500 мг /мл). Матрикс також містить метаболіти і неорганічні іони і пул НАД і НАДФ, що залишаються окремо від піридиннуклеотидів коферментів цитозоля. Мітохондріальна ДНК і всі ферменти, необхідні для реплікації ДНК, транскрипції, і трансляції розташовані в матриксі. Мітохондріальна ДНК містить багато з генів, які кодують транспортні білки електронного ланцюга. Дихальний ланцюг, що розташований у внутрішній мембрані мітохондрій, складають чотири білкові комплекси; функцію трансферів між білковими комплексами I, II та III виконує жиророзчинний кофермент Q (UQ, CoQ), трансфер між III і IV комплексами – водорозчинний білок цитохром c.

Електрони зазвичай потрапляють на кисень по ланцюжку від комплексів I і II до комплеку IV.

Комплекс I –НАДН-КоQ редуктаза

Склад: білок із м.м. 850-kДa;1 флавін мононуклеотид (ФМН) — акцептор/донор 1 або 2 e; 6 — 7 залізо-сірчаних кластерів — акцептор/донор 1 або 2 e; коензим Q — акцептор/донор 1 або 2 е, гідрофобний хвіст, 10 ізопреноїдних одиниць (Q10).

Переносить електрони від NADH на CоQ.

Шлях електронів:

НАДН ––––>> ФМН –––>>FeS–––>> UQ –––>> FeS –––>> UQ.

На кожні 2 електроні поперек мембрани из матриксу у міжмембранний простір за рахунок енергії електронів, що звільнилась на рівні комплексу, –

НАДН-UQ, у міжмембранний простір транспортується чотири H.

Δεо’ = +0.36 V; ΔGо’ = -70 кДж.моль-1

Інгібітори ротенон і амітал

Рис.2 – Комплекс I дихального ланцюга

Комплекс II – сукцинат-CoQ редуктаза

Склад: сукцинат дегідрогеназа; ковалентне зв’язаний ФАД; 1 [4Fe-4S] кластер; 2 [2Fe-2S] кластерів; 1 цитохром b560

Шлях електронів:

Сукцинат –––>> FADH2 –––>> 2Fe2 + ––>> UQH2

Чиста реакція:

сукцинат + UQ –––>> фумарат + UQH2 Δεо’ = +0.015 V; ΔG°’ = -2.9 кДж.моль-1

Δεо’ комплексу недостатня для транспорту протонів в між мембранний простір.

Редокс-потенціал комплексу недостатній для перенесення протонів.

Рис.3 – Комплекс II дихального ланцюга

Комплекс III CoQ— цитохром с редуктаза

Комплекс III (коензим Q-цитохром із редуктаза)

Функція: переносить електрони від CоQ на цитохром с.

Склад: 2 цитохромів b (цитохром b562 або H і цитохром b566 або L); 1 цитохром с1; 1 [2Fe-2S] кластер (залізо-сірчаний білок Rieske). Цитохроми мають характерні смуги поглинання й хімічну структуру.  CoQ переносе електрони цит с в унікальному циклі, відомого як окислювально-відновний цикл Q.Основний трансмембранний білок в комплексі III є цитохром b – з гемами bL і bH. Цитохроми і Fe-S кластери – одно електронні передавачі.

Шлях електронів:

CoQвідн. + цитохром сокисл СoQокисл + цитохром cвідн.

Δε°’= +0.58 V; ΔG°’ = -110 кДж.моль-1

Інгібітор антиміцин А

Рис.4 — Комплекс III дихального ланцюга 

Робота III комплекса забезпечує перекачування 4 протонів.

Комплекс IV – цитохром c оксидаза

Склад: комплекс тварин має м.м. ~200-kDa, трансмембранний білок, димер, містить від 6 до 13 суб’одиниць; суб’одиниці I і II містять окислювально-відновні центри (редокс-активні центри); 2 гема а (гем а й гем a3); 2 Cu центру (CuA або а й CuB або a3); заряджені залишки Asp/Glu взаємодіють із залишками Lys на поверхні цитохрому c. Реакція циклу протікає через бінуклеарний (Cu-Fe) комплекс і проміжне з’єднання феррил (Fe4+).

Шлях електронів:

Цитохром c відн. + 1/2O2 цитохром сокисн. + H2O Δεо’ = +0.58 V; ДG°’ ‘ = -110 кДж.моль-1

Інгібітори: ціанід (CN-), CO, азид (N3 ).

Чотири електрони з цитохрому c використовуються для відновлення молекули кисню і утворення молекули води. Кисень є, таким чином, термінальним акцептором електронів в транспортному шляху електронів.

Цитохром с оксидази використовує 2 гема (a і a3) і 2 мідних сайтів Комплекс IV також транспортує 2 H+

Рис. 5 — Будова та функція IV комплекса  дихального ланцюга.

Сполучення електронного транспорту і окисного фосфорилювання

Цей зв’язок був таємницею протягом багатьох років!

Багато біохіміків розтратили кар’єру в пошуках невловимого «високої енергії проміжного». Пітер Мітчелл запропонував нову ідею – протонний градієнт через внутрішню мембрану може бути використаний для синтезу АТФ. Мітчелл був висміяний, але хеміосмотіческа гіпотеза в підсумку вигрла йому Нобелівську преміюю.

   АТФ-синтаза або комплекс V

Дифузія протонів через білки внутрішньої мембрани призводить синтез АТФ!

Через мембрану мітохондрії можуть вільно проникати тільки невеликі незаряджені молекули і гідрофобні молекули. Енергія, яка виділяється при перенесенні електронів по діхательному ланцюгу, призводить до переносу протонів (Н+) з матриксу мітохондрії в міжмембранний простір. Тому на внутрішній мембрані мітохондрій утворюється градієнт концентрацій протонів: в міжмембранному просторі Н+ стає багато, а в матриксі залишається мало. Утворюється різниця потенціалів 0,14 В – зовнішня частина мембрани заряджена позитивно, а внутрішня – негативно. Нагромаджені в міжмембранному просторі Н+ прагнуть вийти назад в матрикс по градієнту концентрацій, але мітохондріальна мембрана для них непроникна. Єдиний зворотний шлях в матрикс для протонів – через протонний канал ферменту АТФ -синтетази, яка вбудована у внутрішню мембрану мітохондрій

Рис.6 —  Утворення протонного градіенту за рахунок енергії електронів

АТФ-синтаза, що транслокує протон (АТФаза, що відкачує протони, і F1F0-АТФаза); мультісубодиничний трансмембранний протеїн;

F0 — водонерозчинний трансмембранний білок, який складають 10 — 12 типів суб’одиниць; це канал для переміщення протонів із міжмембранного простору в матрикс, де протони утворюють воду с відновленим киснем. Олігоміцин інгібірує синтез АТФ шляхом пов’язання з H+, перешкоджає їх транспорту. F1 — водорозчинний периферичний мембранний білок, який складається з α3β3γδ субодиниць (синтез АТФ забезпечує β — субодиниця); Стрижень складається принаймні з двох білків – олігоміцин-чутливого білка (ОЧБ) і сполучаючого чинника.

Рис.7 — АТФ синтаза

Механізм синтезу АТФ включає три фази.

1) Переміщення H+ за допомогою F0.

2).Каталітичне утворення фосфоангідридних зв’язків АТФ F1

3) Сполучення зниження протонного градієнта із синтезом АТФ при взаємодій F0 і F1 реалізується в три стадії:

– пов’язання АДФ + Фн із «вільним» (L) сайтом;

— конформаційні зміни L в Т (зв’язаний, напружений), обумовлені вільною енергією конфірмаційної зміни L в «напружену» (T) – центр синтезу АТФ;

– АТФ синтезується на центрі Т на одній суб’одиниці, звільнення АТФ здійснюється іншою суб’одиницею, вільна енергія H+ потоку визначає вивільнення АТФ (тобто, T — O перехід). При повному окисленні глюкози  — 29.5 – 31 АТФ.

Рис. 8 — Механізм синтезу АТФ у ротаційному  каталізі.