Человеческий коллаген растительного происхождения (rhCOL1)

Особенности коллагена как фибриллярного белка

Существенная роль коллагена (Кл) как механической основы и регулятора силы взаимодействия внеклеточного матрикса и клеток определяет большой спрос на него как на лечебный строительный материал. Тем не менее, использование Кл, извлеченного из тканей (Тк) животных, связано с проблемами его качества и безопасности, в частности, в отношении его иммуногенности (инициирование реакций иммунной системы), риска передачи заболеваний и общего качества. Параллельно с этим, загрязнение препаратов  Кл нежелательными клеточными факторами может значительно ухудшить его биологическую активность, оказать влияние на мобилизацию клеток, их пролиферацию и дифференцировку.

Коллаген — наиболее распространенная макромолекула внеклеточного матрикса (ECM) и соединительной Тк, тесно связана с формированием Тк, её ремоделированием и ремонтом. Кл обеспечивает существенную архитектурную поддержку и регуляцию ключевых сигнальных каскадов. Дефицит или синтез дефектного  Кл приводит к целому ряду тяжелых наследственных заболеваний внеклеточного матрикса, вовлекающих

сосудистую сеть, кости, сухожилия, десны, волосы и кожу.

Тип I  Кл – это гетеротримерный белок, состоящий из двух альфа1 и одной альфа 2 полипептидных цепей, кодируемых генами COL1A1 и COL1A2. Гены регулируются цитокинами и сигнальными путями преобразователями сигналов и активаторами транскрипции (STATs). Как протеин коллаген подвергается интенсивной посттрансляционной модификации, которая требует согласованной активности различных ферментов, в том числе специфических гидроксилаз, гликозильных трансфераз, протеиназ и одной оксидазы.

Активность комплекса пролил 4-гидроксилазы определяет спиральную конформацию

Кл, который диктует белку термическую стабильность и жизнеспособность. Параллельное гидроксилирование лизина, катализируемое лизил гидроксилазой, играет центральную роль в фибриллогенезе  Кл, стабилизации фибрилл, супрамолекулярной агрегации и минерализации макромолекул внеклеточного матрикса.

Препараты коллагена, выделенного из тканей животных – польза и вред

В течение многих столетий коллаген служил центральным элементом множества медицинских и косметических продуктов, которые использовали его биологические свойства. Преимущества  Кл, материал из которого может быть пропитан экзогенными факторами роста, лекарствами и/или клетками, используется при изготовлении перевязочных материалов, кожных пластырей, наполнителей, заменителей костей и сухожилий, инженерии Тк. В этой связи коллаген нашел применение в регенерации сердечной или костной Тк, ремонте хрящей. Кроме того, как аттрактант фибробластов, введенный в Тк коллаген, инициирует дальнейшее отложение его волокон в месте лечения, ускоряя регенерацию и ремонт.

Благодаря значительной биосовместимости препараты   Кл, как правило, рассматриваются как безопасные лекарственные средства при применении в виде инъекций, имплантации и перорально. Способность к биологическому разложению устраняет необходимость последующего извлечения из Тк устройств с коллагеном.

Традиционно источником коммерческого  Кл является либо трупный материал человека или Тк животных. У 3-10% пролеченных таким коллагеном пациентов наблюдаются как клеточные, так и гуморальные иммунные реакции. Для ограничения иммунных реакций и предупреждения преждевременного рассасывания и нарушения функции имплантата, пациентам назначают иммунодепрессанты. Таким образом, продукты на основе  Кл явно противопоказаны пациентам с аллергией к любому коллагену или к другим продуктам крупного рогатого скота.

Поэтому в соответствии с протоколом лечения коллагеном пациентам предварительно проводят кожный тест, а для выявления лиц, которые приобретают аллергию к коллагену, тестирование повторяют через 2-4 недели после первоначального тестирования.

В дополнение к своей иммуногенности, коллагены на основе биоматериалов животного происхождения несут риск передачи прионов* клеткам человека. Чтобы обойти эти угрозы, регулирующие органы ограничили получения бычьего  Кл только закрытыми стадами, либо животными в тех странах, где о губчатой энцефалопатии (коровье бешенство) никогда не сообщалось.

Биопрепараты коллагена человеческого происхождения  – польза и вред

Использование  человеческого Кл   преодолевает ряд недостатков, связанных с бычьим или свиным коллагеном, но возраст д ра, экологическая обстановка, этническая принадлежность и генотипы источника коллагена, определяют заметную изменчивость качества образцов. С возрастом сети Кл подвергаются межмолекулярному сшиванию, что сопровождается потерей мощности осмотического набухания, снижением эластичности и растворимости в кислоте, повышению устойчивости к коллагеназе. Кроме того,  при экстракции из Тк,  нежелательные меж- и внутримолекулярные сшивки в коллагене приводят к тому,  что около  30% общего веса  Кл составляет   видоизмененный протеин Полученный материал проявляет неоптимальную растворимость и способность собираться в хорошо структурированные строительные блоки.

Эти ограничения, наряду с расширением потребности в терапевтических препаратах на основе  Кл, определили поиск   возможностей  получения рекомбинантного человеческого коллагена (rhCOL1) на растительной основе.

Генная инженерия в решении проблем    безопасности и качества коллагена

Выход был найден специалистами в области генной инженерии. Оказалось, что если в геном табака встроить ген человека, кодирующий синтез  Кл, то табак способен к масштабному производству рекомбинантного человеческого коллаген типа I (rhCOL1). Табак явился источником гомогенного (однородного), гетеротримерного (молекула из трех разных полипептидных цепей, термически стабильного, высоко аффинного к клеткам Тк, чистого  Кл. Этот коллаген применяется как для формирования многочисленных функциональных каркасов в тканевой инженерии, так и регенеративной медицине. Кроме того, rhCOL1 человеческий, синтезированный растением, может образовывать жидкие кристаллические структуры, что позволяет получать хорошо организованные и механически прочные мембраны.

Извлеченный белок является чистым, гетеротримерным, водорастворимым, свободным от примесей с высокой молекулярной массой, гидроксилированным подобно человеческому коллагену по остаткам пролина и лизина. В результате «девственный» человеческий rhCOL1 растительного происхождения компонуется в 3D-структуру с сохранившейся родной α-спиральной структурой. Структура  Кл имеет большую площадь поверхности, сайты связывания интегринов на клетках близкие к идеальным. Кроме того,  rhCOL1 является высоко гидрофильным (рис.2).

Рисунок 1. Схематическое представление ключевых различий между коллагеном тканевой экстракции и человеческим коллагеном растительного происхождения. Растительного происхождения человеческий коллаген типа I (rhCOL1) обладает естественной альфа-спиральной структурой, которая формирует    естественные домены связывания  с клетками, в то время как   коллаген,экстрагируемый из тканей, лишен многих своих клинически значимых связывающих доменов, наряду с образованием  сшивок, которые оказывают влияние на  структуру и функции белка. Растительного происхождения человеческий коллаген образует функциональные 3D-матрицы, которые превосходят возможности таковых у   Кл, экстрагируемых из ткани. rhCOL1 обеспечивает оптимальную среду для пролиферации клеток и ускоренное заживление ран, без проблем антигенности и иммуногенности.

Урожай табака приносит значительные партии высоко гомогенного  rhCOL1 с одинаковыми физико-химическими свойствами, идентичными естественному, в то же время, полностью снимает проблемы антигенности, иммуногенности и передачу заболеваний.

Таким образом, биофабрика на основе табака  не просто обеспечивают низкую стоимость и высокий выход rhCOL1, но также обеспечивает более безопасный и функциональный протеин,  который наиболее близко имитирует его естественный аналог (Таблица 1).

Таблица  — Ключевые физические и  биологические свойства  человеческого коллагена растительного происхождения
Характеристики Преимущества Положительный эффект
Аминокислотная последовательность  человеческого коллагена  Неиммуногенный   Улучшенная биосовместимость
Структура тройной спирали
  • Повышенная стабильность
  • Плотно упакованные волокна
  • D-полосная исчерченность
  • Улучшенная адгезия клеток и пролиферация клеток
  • Ускоренное исцеление
  • Улучшенные механические поддерживающие свойства
  • Оптимальные процессы заживления
  • Простота обработки (электроспиннинг)
Несшитые

молекулы коллагена

  • Более высокая растворимость
  • Более высокая организация волокна
  • Контролируемая степень сшивания
  • Контролируемаяй биодеградация
  • Улучшение механических  свойств строительного каркаса
  • Контроль роста новой ткани
  • Повышение безопасности
  • Улучшение клеточной пролиферации и адгезии
Готогенность. Образование жидких кристаллов Манипулирование физическими свойствами (например,предел прочности при сжатии  и при растяжении; модуль упругости) Оптимизация з-х мерной подложки носителя по различным показаниям однородность продукта
Материал произведен растением
  • Свободной от загрязнений тканями  животного
  • Чистый, не переработанный материал
  • Устойчивые свойства сырья
  • Повышение безопасности
  • Однородность продукта
Гидрофильность
  • Более высокая растворимость
  • Высокое удержание жидкости
  • Повышенное связывание клеток
  • Повышенное связывание фактора роста
  • Идеальное средство доставки для факторов роста
  •  Позволяет снижать    факторов роста
  • Воспроизводимая подложка
  • Повышенная безопасность

Разумное использование уникальной особенности rhCOL1 закладывает  базис для целенаправленного дизайна образцов тканеспецифических коллагенов для широкого спектра медицинских и фармацевтических дисциплин.